生物传感器概述

 

微流控生物传感器(microfluidic biosensor)是微流控技术重要的分支和延伸，包含了微流控技术和生物传感器技术多种优势，在检验医学领域已展现出巨大的潜力。微流控生物传感器具有其独特的特点和多种技术原理，目前在检验医学特别是分子诊断方面已取得了大量的应用进展。

 

 微流控生物传感器的特点

 

微流控生物传感器是指在微流控芯片的技术上集合传感元件，从而实现从流体输注、控制到信号接收、转换、呈现一体化的检测装置。

微流控生物传感器包括两大核心技术：一是微流控技术，又称为芯片实验室(lab-on-a-chip)，顾名思义是"实验室操作集成在芯片上的技术"，一般是指在几平方厘米内构建的化学、生物、医学实验室。微流控芯片的主要特征在于操控微小体积的流体(10－9～1018L)，通过微小密集的网络布局(10－6～10－9m)的流道发挥特定的功能。微流控芯片相比于常规宏观尺度的实验技术具有若干基本特征：在微流体流动中惯性影响力可以忽略不计，黏性力为主要影响因素，雷诺系数很小，流体在管道内以层流(laminar flow)形式流动。微管道比表面积大，体系内传热迅速，因此在恒温条件下反应产率和转化效率相比宏观体系得到提高。微管道尺度微小，试剂消耗量小于常规技术方法1～3个数量级，大大降低试剂成本，减少废液的排放。

二是生物传感技术，生物传感技术是指通过声、光、电、磁等元件将生物分子转换为可输出和测量的信号，从而实现生物信息的传感。生物传感器的优势首先在于灵敏度高，相比传统的大型分析仪器，生物传感器针对的局部微小区域，即使是微弱的生物信号，也能被采集到并进行信号放大。其次，生物传感器往往采用的是无标记技术，可以长时间实时检测，并且敏感材料不会被消耗掉。
再次，生物传感器体积微小，可实现多通道，阵列化，应用范围更为广泛。微流控生物传感器将上述微流控技术和生物传感技术有机结合在一起，利用微流控技术在同一微小芯片上既实现了检验医学领域所涉集的样品制备、分离、反应、清洗，又通过生物传感技术采集、处理和分析信号，并且可以实现阵列化的高通量检测，实现整个检验过程"从样品到结果"的功能。

 

微流控生物传感器的技术原基于微流控芯片传感器分类

 

1．流道式微流控生物传感器

流道式微流控生物传感器是目前运用最多的类型，具体又可划分为连续流动式和液滴式，流道式微流体管道为封闭式管道，通过注射泵和气阀来控制液体的流动和截止，从而实现液体的连续流动和精确控制。连续流动式微流控芯片目前可以精确处理纳升级的液体量，从而实现单细胞甚至单分子水平的研究。
液滴式微流控芯片，通过液滴发生器可高通量地产生液滴，液滴的本质为油相包裹了水相，通过改变水相的内容物，可将每个液滴视作一个个独立的微反应器。这一个个小液滴体积非常小，通常为10－15～10－19L，样品量极少，可用于进行高通量筛选和敏感的生物测定。

其次，由于油相的包裹样品在油滴内稳定，蒸发和互相污染现象可以有效控制，目前已广泛应用于数字PCR领域。流道式微流控芯片由于其设计的灵活性和可拓展性，适用于多种生物传感器信号转换类型，包括基于光学的表面增强拉曼光谱法、基于声学的石英晶体微天平法、声表面波法和基于电化学的电化学阻抗法。

 

2．数字微流控生物传感器

数字微流控是指在微流控芯片内通过电、声波、热、化学等方法实现液滴的驱动，降低人为操作带来的误差，常见的方法有介电电泳、介电润湿、热毛细管效应、声表面波、静电力方法等。其中介电润湿法相较于其他方法具有驱动能量低、外设较简单，在数字微流控芯片操纵液滴中使用最为广泛，数字微流体在电介质涂层电极阵列上操纵独立的液滴，在电极阵列上施加一系列的电势，通过数字编码，对电极进行开关调整从而实现液滴的驱动、合并、混合和分离。

数字微流控可以在一个或者两个控制面板上工作，并且已达到处理从皮升级到微升级大小液滴的能力，从而减少试剂消耗，反应更加自动化。与流道式微流控不同之处在于，数字微流控对泵阀以及机械混合装置没有很高的要求，并且可以控制单个液滴的驱动。此外，数字微流控对液滴的控制可通过编程而改变，可根据不同实验要求，定制相应的程序，使其应用前景和应用范围更为宽广。

数字微流控技术另一大优势在于通过电极的驱动从而减少含有不溶物液体的堵塞现象。由于数字微流控技术集成有电子元件，因此可以和大多数生物传感技术相结合，使数字微流控生物传感器成为控制复杂生物检测的强大的微流控工具。目前已报道的数字微流控生物传感器有表面等离子共振成像、电化学检测、电化学发光检测等。数字微流控生物传感器可用于如免疫分析、细胞培养、DNA杂交检测、法医学、分离科学等多个领域。

 

3．纸基微流控生物传感器

相对于微流控芯片的封闭流道而言，纸基微流控芯片管道是开放式的。纸是由纤维素构成的多孔基质，有很好的液体吸收能力。当进行疏水处理后，液体将通过毛细作用精确地只在亲水管道流动。纸基微流控芯片在便携式、低成本、即时检测领域有着光明的前景。目前临床检验应用广泛的免疫侧向试纸同样基于此原理，但试纸条无法精确定量，且无法多重检测。而纸基微流控芯片则很好地解决了这个问题。纸基芯片的制备非常简单，总体来说，纸基微流控芯片只要能形成疏水图案都具有可行性。

目前制备纸基微流控的方法主要有两类：平板印刷的方法具有较高的分辨率但价格较贵；直接打印疏水的障碍通道的方法相对仪器设备要求较低。Martinez团队开发的3D微流控纸分析系统(3D μPAD)以特定图案的层层堆叠的纸以及防水双面胶制备而成，通过双面胶连接堆叠的管道，使液体竖向流动到不同层的管道内，可同时检测4个人的血糖和蛋白成分，整个检测过程只需2 min。纸基微流控芯片价格低廉，操作简单，无需外力驱动，但同时纸基微流控芯片的局限性限制了其应用，例如由于驱动力依赖层析作用实际达到测试区域的只有样品体积的50%，纸基芯片开放的管道在加热时易导致溶液蒸发，并且更易受环境因素的影响。纸基生物传感器最经典的例子当属血糖检测仪。不需要多步样品和试剂更换、洗涤的方法更适用于纸基传感器诸如人绒毛膜促性腺激素早早孕检测和心肌蛋白检测等。

目前纸基微流控生物传感器主要集中于光学和电化学传感器。通过胶体金比色反应或者化学发光，并用智能手机摄像头进行信号采集和定量分析。

 

微流控生物传感器在分子诊断应用进展

 

分子诊断在目前精准检验医学所占的比重越来越大，肿瘤的转移复发、靶向药物的筛选、胎儿的产前诊断等均有赖于分子诊断。而在微流控生物传感器方面，核酸扩增技术同样也发展最为成熟，基于不同类型的核酸扩增方法均有大量报道，包括实时荧光定量PCR芯片、逆转录PCR芯片、液滴PCR芯片、数字PCR芯片等，以及基于恒温扩增技术的环介导等温扩增、滚环扩增、重组酶聚合酶扩增等手段的微流控芯片。在数字微流控芯片中少量的模板DNA和试剂被封装在液滴或微孔内，允许在相对传统DNA扩增方案(例如PCR)更短的时间内分析珍贵的核酸样品。

目前微流控芯片已实现了分子诊断领域大部分的技术方法，包括基因分型、基因突变、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位点检测、疾病相关微小RNA检测，DNA测序等。本文以微流控生物传感器在分子诊断领域的进展为切入点对微流控生物传感器做具体的应用介绍。

 

1．病原微生物核酸检测

感染性疾病的分子诊断相对于细菌培养方法，在灵敏度、快速等方面均有显著的优势，目前微流控生物传感器对感染性疾病的检测已实现了多样品来源如唾液、口腔上皮细胞、血浆等，检测种类涵盖多种细菌、真菌、病毒检测。Ma等设计了一个集成的，自驱动的微流控芯片用于数字环介导等温扩增技术反应(loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)。整个检测过程可以通过毛细作用力在芯片上自动完成，30 min内对耐万古霉素肠球菌菌株特异性基因进行扩增，检测限仅为11个拷贝。

 

2．肿瘤相关基因突变检测

人体大部分的肿瘤与基因突变有关，微流控芯片与多种基因突变检测方法相结合，在基因突变检测方面已取得了很大成功。韩国的Heo等开发了一种新型旋转微流体装置，可以对TP53基因的突变位点进行多重SNP分型。微流控芯片上有12个反应室。可以通过旋转顶部旋转盘来进行一系列样品注射，连接滚动循环扩增反应从而对基因突变进行检测。

 

3．DNA甲基化修饰检测

表观遗传的改变是最早期的疾病发生标志物，对于预测疾病发生的风险具有重要意义。DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，即在胞嘧啶残基上修饰甲基，形成5-甲基胞嘧啶。这种修饰广泛涉及基因表达的调控。启动子区域高甲基化与一些关键肿瘤抑制基因的沉默有关，并且发生在癌症最早期阶段。因此，DNA甲基化变化被认为是癌症检测和诊断的潜在生物标志物。中科院上海微系统与信息技术研究所Wu等开发了一种基于微流控数字PCR技术用于甲基化整合检测的微流控生物传感方法。该方法依赖于甲基化敏感的限制性内切酶，该限制性内切酶切割未甲基化的DNA链，同时保持甲基化的DNA完整。限制性内切酶处理后，通过基于微流体芯片上成千上万个小腔室将样品分割为若干的独立区域，通过数字PCR定量测定DNA甲基化水平，检测下限等于0.52%。与常规亚硫酸氢盐焦磷酸测序分析结果一致。